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中國科學(xué)院微生物研究所劉宏偉課題組發(fā)表文章： Iizuchalasin A，一種罕見對稱籠狀結(jié)構(gòu)、抗多重耐藥金黃色葡萄球菌的海洋真菌新型抗生素

全球病原菌抗生素耐藥問題日益突出，多重耐藥金黃色葡萄球菌（包括MRSA和MDRSA）等"超級細菌"對臨床治療帶來重大挑戰(zhàn)，如何挖掘、開發(fā)化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、作用機制獨特的抗生素已成為抗感染藥物研究的關(guān)鍵前沿。一直以來，Lipinski等人提出的類藥5規(guī)則，為藥物的發(fā)現(xiàn)提供了很好的指導(dǎo)，提高了藥物發(fā)現(xiàn)效率。其中規(guī)則中規(guī)定藥物的分子量應(yīng)該小于500 Da，但隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)逐漸進入瓶頸期，而且以達托霉素、萬古霉素、棘白菌素、兩性霉素為代表的抗生素分子量遠在500以上，這提示我們，較高分子量的天然產(chǎn)物，因其具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特殊的理化性質(zhì)，往往具有獨特的生物活性，是潛在的天然抗生素資源。中國科學(xué)院微生物劉宏偉團隊，長期致力于特殊生境（高原、海洋、腸道等）微生物活性分子發(fā)現(xiàn)、生物功能與作用機制研究。劉宏偉團隊與沈陽藥科大學(xué)合作，采用代謝組學(xué)分析、針對多重耐藥病原菌的活性篩選，從一株海洋真菌Aspergillus iizukae中分離獲得，具有罕見的高度對稱的籠狀“蝴蝶樣”骨架merocytochalasan類天然產(chǎn)物Iizuchalasin A，該分子由兩個相同的aspochalasin-epicoccine單元通過多點共價連接，形成包含17個環(huán)和32個手性中心的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)。該分子抑制多藥耐藥金黃色葡萄球菌、多藥耐藥肺炎鏈球菌和萬古霉素耐藥腸球菌生長，對MRSA顯示較強體內(nèi)抗菌活性，作用靶點是磷壁酸轉(zhuǎn)運蛋白TarGH胞外結(jié)構(gòu)域，結(jié)合方式不同于現(xiàn)有的TarGH抑制劑。該分子不易誘導(dǎo)耐藥，且耐藥突變菌失去毒力和致病力，顯示非常好的臨床應(yīng)用前景。

多重耐藥金黃色葡萄球菌為靶標，對Aspergillus iizukae PJ03-11的提取物進行了活性測試，結(jié)合代謝組學(xué)分析，鎖定含有中高分子量化合物的活性組分進行定向分離，獲得了八個merocytochalasan類化合物，其中包括四個新化合物（1,4,5,6）。Iizuchalasin A（1）兩個相同的aspochalasin-epicoccine單元通過多點共價連接，形成包含17個環(huán)和32個手性中心的罕見的高度對稱的籠狀“蝴蝶樣”骨架，結(jié)構(gòu)通過質(zhì)譜、核磁共振以及X射線單晶衍射等確證。

在抗菌活性評估中，1表現(xiàn)出了中等強調(diào)的抗菌活性，其對甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）、甲氧西林耐藥金葡菌MRSA、多藥耐藥金葡菌MDRSA、多重耐藥肺炎鏈球菌（MDRSP）、萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）均顯示出活性，對表皮葡萄球菌則無活性。值得注意的是，1對MDRSA的活性優(yōu)于除萬古霉素外的常用臨床藥物，提示其作用靶點不同現(xiàn)有臨床抗生素。更為重要的是，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)化合物處理阻止了細菌分裂，并可以顯著促進細胞外膜囊泡分泌，提示可能作用于細菌細胞壁結(jié)構(gòu)。此外，1表現(xiàn)出極低的誘導(dǎo)耐藥性，且耐藥突變菌失去毒力和致病力。

為了進一步確定化合物1的作用靶點，團隊對一株MIC提升了8倍的突變株（ISAD30）進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)了2個截短突變基因srrB和vraG和4個點突變基因tarG（Y217D）、ybez（Y301H）、rpoA（R289C）和gdpD（G144E）。選擇與細胞壁合成相關(guān)TarG（ABC轉(zhuǎn)運蛋白TarGH的跨膜組分，負責(zé)壁磷壁酸前體的翻轉(zhuǎn)）和GDPD（甘油磷酸二酯磷酸二酯酶）深入研究。首先在金黃色葡萄球菌中進行目標基因的過表達，結(jié)果顯示過表達TarGH顯著提高1的MIC（8 to 32 μg/mL），而過表達gdpD僅產(chǎn)生中等影響（8 to 16 μg/mL）。TarGH 作為壁磷壁酸（WTA）的翻轉(zhuǎn)酶，介導(dǎo) WTA 前體從細胞膜內(nèi)側(cè)向膜外側(cè)的跨膜轉(zhuǎn)運；而 TarO 是 WTA 合成途徑的起始酶，催化第一步糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。若 tarO 缺失，WTA 合成被完全阻斷，TarGH 因缺乏底物而無法發(fā)揮作用，導(dǎo)致靶向 TarGH 的抑制劑失去抗菌活性。敲除壁磷壁酸合成途徑中的tarO基因，降低了菌株對1的敏感性，MIC值提升了10倍以上，與已有的TarGH抑制劑（如targocil）的作用特征一致。TarGH基因作為必須基因無法在金黃色葡萄球菌中敲除，進一步，團隊用金黃色葡萄球菌的tarGH基因替換枯草芽孢桿菌內(nèi)源的tagGH基因，該重組菌對1的敏感性急劇增加16倍，直接證明了1的作用靶點是金黃色葡萄球菌來源的TarGH蛋白。

進一步的生物化學(xué)實驗證實了1與TarGH的直接相互作用及其抑制活性。體外ATP酶活性實驗表明，1抑制重構(gòu)的TarGH復(fù)合物的ATP酶活性，IC50值為2.25 μM。微量熱泳動實驗則直接檢測到了1與TarGH蛋白的結(jié)合，其解離常數(shù)Kd在非水解ATP類似物AMP-PNP存在下為17.1 μM，顯示出比ATPγS（Kd = 31.2 μM）更強的結(jié)合能力，與已知TarGH抑制劑targocil-II的作用模式相似。基于以上綜合證據(jù)，團隊最終確證了TarGH是1在金黃色葡萄球菌中抑制細菌生長的一個關(guān)鍵靶點。

為了確定化合物在TarGH上的結(jié)合位點，對系列耐藥突變株的tarG基因進行測序，發(fā)現(xiàn)所有菌株TarG蛋白的第217位酪氨酸（Y217）發(fā)生了點突變（主要為Y217D）。進一步分子對接和增強采樣的動力學(xué)模擬提示，1的結(jié)合可能通過增加TarG蛋白EH1-EH2結(jié)構(gòu)域間的角度，誘導(dǎo)EL-loop構(gòu)象重排，從而阻塞底物運輸通道，其結(jié)合主要依賴范德華力和疏水相互作用。這一位點已被報道是多種TarGH抑制劑（如targocil, targocil-II等）的耐藥位點之一。結(jié)合腔附近Y217C、F82A、Y190S等突變對1的敏感性產(chǎn)生顯著影響，對targocil影響較小。因此，由于其獨特的大型籠狀分子骨架，盡管我們的研究結(jié)果顯示化合物1與 targocil 作用于相同的靶點，二者卻呈現(xiàn)出不同的結(jié)合模式。

圖1：化合物結(jié)構(gòu)（A）、體外抑菌活性與細胞形態(tài)（B）、作用靶點（C）

圖2：化合物1與TarGH的結(jié)合模式分析

在小鼠皮膚感染模型中，含1的制劑顯著降低了傷口處的細菌載量。在系統(tǒng)性感染模型中，1能顯著提高小鼠的存活率，顯示出良好的體內(nèi)藥效。此外，由于壁磷壁酸的合成與細胞粘附和毒力密切相關(guān)，1還能抑制S. aureus對宿主細胞的粘附，并下調(diào)重要毒力因子如酚可溶性調(diào)控蛋白(PSM)和葡萄球菌A蛋白(SpA)的表達，顯示出“抑細菌 抗毒力”的雙重機制。

作用機制總結(jié)：

Iizuchalasin A (1) 靶向T結(jié)合于WTA 轉(zhuǎn)運蛋白的跨膜亞基TarG，通過抑制其ATP 水解偶聯(lián)的轉(zhuǎn)運功能，阻斷了胞內(nèi)合成的WTA 前體向胞外的翻轉(zhuǎn)，賦予1多樣的抗菌作用機制。WTA 的缺失直接破壞了肽聚糖的交聯(lián)和細胞壁的完整性，導(dǎo)致細胞壁通透性增加、形態(tài)異常（如電鏡觀察到的細胞壁增厚和膜泡釋放），最終引起細菌裂解死亡。同時，細胞壁結(jié)構(gòu)變化和環(huán)境壓力，進一步激活了VraRS 雙組分系統(tǒng)（vraR,vraS上調(diào)），下調(diào)了agr群體感應(yīng)系統(tǒng)（Quorum Sensing）的核心基因（agrA, agrC, agrB及RNAIII），下調(diào)下游關(guān)鍵毒力因子的表達。這種對毒力因子的轉(zhuǎn)錄抑制解釋了為何1能夠有效阻斷S. aureus對宿主細胞的粘附并降低其致死率。

靶向TarGH的新型抗生素一方面破壞細胞壁合成來“殺菌”，另一方面也可通過干擾agr信號通路來“減毒”，從而在體內(nèi)表現(xiàn)出卓越的抗感染療效，值得深入開發(fā)和研究。